硅胶柱层析
硅胶柱层析原理
硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。
硅胶柱层析流动相
极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸
硅胶柱层析惯用方法
1.称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。
2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。
3.装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。
4.压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。
5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。
6.过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。
7.检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。
8.送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰
硅胶柱清洗方法
正相的我们一般都只使用一次，反相的才反复使用。
在做实验时我们用硅胶装的玻璃柱在使用时一般都是一次性的，但如应用至规模化生产时这样的操作不免很浪费，可以想像，一根装有接近200kg硅胶填料的柱子在使用一次后就扔掉的壮观景象。当然，重复使用的情况一般在物料纯度较高，色素很少的情况下才能实现。我们曾经尝试过装好的柱子(180kg填料)可以重复使用近12次，而且在使用的过程中，第一次的效果并不是最好的，从第二次开始到后来层析的效果比较稳定，效果也不错，然后是有一个缓慢下降的趋势，到最后不能使用却是突然性的。
如果物料纯度确实太差，那也没办法，只能将用过的硅胶拿去再生后重复使用了。
硅胶在使用过程中因吸附了介质中的水蒸汽或其他有机物质，吸附能力下降，可通过再生后重复使用。
一、硅胶吸附水蒸汽后的再生
硅胶吸附水份后，可通过热脱附方式将水份除去，加热的方式有多种，如电热炉、烟道余热加热及热风干燥等。
脱附加热的温度控制在120--180℃为宜，对于蓝胶指示剂、变色硅胶、DL型蓝色硅胶则控制在100--120℃为宜。各种工业硅胶再生时的最高温度不应超过以下限度：
粗孔硅胶不得高于600℃；
细孔硅胶不得高于200℃；
蓝胶指标剂（或变色硅胶）不得高于120℃；
硅铝胶不得高于350℃。
再生后的硅胶，其水份一般控制在2%以下即可重新投入使用。
二、硅胶吸附有机杂质后的再生
⒈ 焙烧法
对于粗孔硅胶，可放在焙烧炉内逐渐升温至500--600℃，约经6—8小时至胶粒呈白色或黄褐色即可。对细孔硅胶，焙烧温度不能超过200℃。
⒉ 漂洗法
将硅胶在饱和水蒸汽中吸附达到饱和后放热水中浸泡漂洗，并可结合使用洗涤剂以除去废油或其它有机杂质，再经净水洗涤后烘干脱水。
⒊ 溶剂冲洗法
根据硅胶吸附有机物种类，选用适当的溶剂将吸附在硅胶内的有机物溶出，然后将硅胶加热以脱除溶剂。
三、硅胶再生应注意的问题
⒈ 烘干再生时应注意掌握逐渐提高温度，以免剧烈干燥引起胶粒炸裂，降低回收率。
⒉ 对硅胶焙烧再生时，温度过高会引起硅胶孔结构的变化而明显降低其吸附效果，影响使用价值。对于蓝胶指示剂或变色硅胶，脱附再生的温度应不超过120℃，否则会因显色剂逐步氧化而失去显色作用。
⒊ 经再生后的硅胶一般应过筛除去微细颗粒，以使颗粒均匀。
正相、反相和极性胶联柱使用手册
Chrompack HPLC Normal-,Reversed phase and Polar bonded columns
注意
此色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（pH>7.0）或酸性溶剂（pH<2.0）会导致柱子损坏。在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。未正确地使用不能享受保修待遇。
1． 简介
此柱填充的是反相或者极性胶联型态的硅胶基质材料的硅胶。硅胶形态的柱子用于正相（非水）条件。
反相（C8，C18，ODS，RP-8和RP-18）通常用于反相条件（水相）。
极性胶联型（APS，diol，CN和NH2）依照应用目的，可以用于正相和反相条件。建议不要将一个相同的柱子用于差别非常大的条件下，这是因为柱子在特定的条件下，固定相的性质会发生变化，所以在其他的条件下，会影响柱效。也不建议将硅胶柱用在反相条件下或者将方向柱用在正相条件下，这是因为这种过程会发生重复性差的问题（每一次注射之间和柱与柱之间的比较）。
2． 色谱柱老化
在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。
A．在反相条件下老化
要老化这类柱子，首先要使用乙腈或者甲醇淋洗，然后你选用的洗脱液进行平衡。
在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。
如果流动相中使用了添加物（例如缓冲液或离子对试剂），建议使用正确比例的但不含此添加物的流动相进行缓冲冲洗。缓冲冲洗应当首先以低流速进行，最后再使用正常流速。
B．在正相条件下老化
柱效可能会受水与固定相的键合的严重影响。柱子的干燥（激活）或润湿（失活）可能是需要的。使用的溶剂可能是水饱和的或者是无水的。干燥柱子可以使用无水的二氯甲烷。
C．对于极性键合柱的特殊说明
由于这些柱子可以用于反相或者正相条件，在进行老化以前，一定要首先检查你要使用的淋洗溶剂或洗脱液是否可以与封装在柱子里的溶剂相混溶。如果这些溶剂不能混溶，必须先使用一个合适的缓冲溶剂进行冲洗。
3．洗脱液
注意第节和第2节。一定不要使用pH低于2或者高于7的缓冲液，这是由于它们会改变固定相的性质。极性键合柱最好使用在3到5 之间。在使用以前，洗脱液要进行脱气，以及使用0.5微米的滤膜过滤，以免发生检测和泵送问题。
一定要在开始使用系统以前检查水溶液中有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。
4． 流量和压力
注意：最高压力：不锈钢柱：4500psi；玻璃柱：3000psi
增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。
如果你想更换柱子，，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。
拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。
高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。
使用保护柱（见第6节）会防止污染物沉积在分析柱上。
5．样品准备
保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。你必须防止将疏水性/与流动相极性差别很大的化合物泵入色谱柱，不管是来自流动相还是样品。特别地，要禁止导入颗粒杂质。这些最终都会造成操作压力的增高而且非常困难或者不可能去除。
6．保护柱
一定要使用保护柱，因为样品和洗脱液污染可能会造成柱压力的增高而且影响选择性。对于ChromSep 柱我们建议使用正确型号的ChromSep 保护柱。这个柱子的填充材料与用于分析的色谱柱的材料相似。当柱压增高的或者观察到柱效降低的时候就需要更换保护柱了。对于常用不锈钢柱，我们建议使用相同型号的Chromguard High Efficiency（高效）柱(10X3.0mm) 或High Capacity（高容量）柱(50X3.0mm)。
7．进样量和浓度
柱子的最大载样量取决于：柱子的型号，使用的条件和样品的类型。很难给出一个一般的指示。
注射了太大体积或太浓的样品会使峰展宽或者峰融合。
8．温度
HPLC柱最好在柱温箱中使用。重复性取决于温度控制。最佳的温度与特定的应用有关。温度影响洗脱液流动的线速度。在使用ChromSep玻璃柱的时候，一定要调节流速使压力保持在3000psi以下。
9．贮存
一定不要在柱子内充满缓冲液或者其他含盐类的洗脱液的情况下贮存色谱柱。 贮存溶剂应当含有至少20%的有机溶剂，以防止有细菌的生长。
10． 柱效损失的可能原因
1． 额外的峰展宽。当使用小直径或者长度较短的柱子时，峰展宽的情况可能比较明显。要保证管路的长度和内径都保持最小。检查进样体积和检测器检查池体积是否适用于柱体积。
2． 洗脱的平衡时间不够。
3． 不正确柱温。
4． 不正确的修正浓度。
5． 床压缩。使用了过大的洗脱流速。将柱子反向，使用低流速。
11.柱效丧失和/或高背压
1．颗粒物积聚在烧结物或者树脂床上（它们都会使背压增高）。如果柱压增高了，将柱子与进样器断开，运行泵，以验证背压的来源确实是来自柱子的颗粒污染（样品、洗脱液和系统）。倒转柱子，以反向的流动来冲洗柱子。如果这样不能解决问题，更换进口过滤器或者筛板。
2．微生物在洗脱液中生长。倒转柱子，尝试以反向的流动来将污染物冲洗出柱子。更换进口过滤器或者筛板。
3．有蛋白质脂肪，油脂污染或者极性化合物等污染。再生柱子（见第12节）。
12.再生
1．再生反相色谱柱
a．首先倒转柱子。
b． 以大约最佳流速的40%的流速冲洗柱子大约45-60分钟，使用的溶剂的顺序要按照水—甲醇—异丙醇—二氯甲烷—异丙醇—甲醇—水进行。
c． 柱子转回正常方向，使用分析所用洗脱液平衡。
注意：在使用另外的淋洗方法的时候，一定要先用水开始冲洗以去除缓冲液，保证其后的洗脱液可以混溶。
2．再生硅胶柱
a．首先倒转柱子。
b．以大约最佳流速的40%的流速冲洗柱子大约45-60分钟，使用的溶剂的顺序要按照异辛烷（或己烷）—乙酸乙酯—干燥的异辛烷（或己烷）进行。
c．柱子转回正常方向，使用分析所用洗脱液平衡。
3.再生极性键合柱
取决于使用的条件，可以使用反相的条件，也可以使用硅胶柱的条件。
注意：绝对不要使用酮类或醛类冲洗氨基柱，因为可能与固定相发生反应。四氢呋喃作为替代可以使用。
作者: ruitao 发布日期: 2008-11-13
我用的普通硅胶的柱料,不是液相上的反相柱,感觉吸附的厉害,有颜色.请问怎么再生啊
硅胶柱层析惯用的方法：匀浆法。
1。称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。
2。搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。
3。装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。
4。压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。
5。上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。
6。过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。
7。检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。
8。送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。
1.先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质Rf值之差最大化
2.将柱子必须装平整、均匀
3.考虑有限柱填料的吸附量
4.可考虑用剃度法分开并洗脱
关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。
柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是
样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二
厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只
有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多
的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，
不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选
择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质
相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子
）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也
可以减小淋洗剂的极性等等。
真空液相层析即vacuum liquid chromatography(VLC),即用真空代替压力进行层析，具体方法可见Synthesis,2001,No,16,2431-,and J chem edu,1997,10,1222-
干法上样，一般用于固体或粘度大的液体样品。样品用低沸点易溶溶剂溶解，加入1-3倍的粗硅胶，晾干或旋干，干燥的标准是硅胶成细粉而不粘在瓶壁上。装好的柱子上留一段溶剂，把吸附了样品的硅胶慢慢到进去，震动柱子或再加一些溶剂，把粘在柱壁上的硅胶洗下
常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相
的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望
能有所帮助。
柱子可以分为：加压，常压，减压。
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所
以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分
离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过
硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得
不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过
减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念
头了。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力
的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解
的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得
加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品。
可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅
胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也
是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是
加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显
色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十
个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以
前过一根无水无氧柱，需要六个schlenk，现在只一个就能把所要的全收集到。
无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，
很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中
性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。
听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一
照就知道产品在哪里了，没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。
关于湿法、干法上样。
湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好
，不然溶剂就成了淋洗剂了。
很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一
般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较
好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶
那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。
有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走，
显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1：
1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样
品没有吸附在硅胶上）。
溶剂的选择。
当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中有写用
正己烷的，太贵了，除非特别需要不要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快，不过因
为极性很小，有时还是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别
让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸
附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些
。甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后
继处理，比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。
由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用10升或25升的塑
料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色
的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过
原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。
另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点
是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和
乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋
洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，因为
在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象，如果杂质和
你下面要过的样品有反应那就惨了。
关于操作问题。
1 装柱。
柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。
干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧
密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。书中写
的都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就
全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是
开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚至作废！
2 加样。
用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再
加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。
加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（2～4cm就够了）
，再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。
3 淋洗剂的选择。
感觉上要使所需点在rf0.2～0.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过
柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一
个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3
）的三次方或四次方大。
4 样品的收集。
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比
较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以
采用氧化铝作固定相。
另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就
收到了三个样品，wuwu。如果都用小试管那工作量又太大。
5 最后的处理。
柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送
分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没
了，必要时进行重结晶。
实验室常用的正向柱分离有加压、常压和减压等，我原是做天然产物全合成的，也做过少量天然产物分离工作。还常用到反向柱。
正向柱分离
1.TLC
1)加压、常压柱
主点Rf 0.5左右，相近的组份要能分开。
2)减压柱
主点Rf 0.1左右，相近的组份要能分开，或次组份在原点。
2.硅胶或氧化铝等
1)加压、常压柱
60到200目
2)减压柱
300目以上
大空树脂挺好，但自己用得少。硅藻土很多时侯也很好。
3.柱径
好分、量大，柱径可大些；难分、量小，柱径可小些。
4.柱长
与柱径相似，好分、量大，柱长可短些。
5.制样
减压一般是干法拌样；加压、常压可干法拌样，也可湿法备样。
6.洗脱液
老板科研经费多，用加压、常压耗溶剂太多；要想给老板省钱，给自己省时间，就用减压。
7.接液
主点未出，多接；主点快出来及快出完，少接。
8.收率
对同一样品且同量减压一般收率低；加压、常压一般收率高。
9.备柱
无论减压、加压、常压；无论干法、湿法备柱。填料要想法压实，且备柱或过柱时均不可有气泡、断层、干柱（减压除外。），否则一切从头开始。
过硅胶柱的经验
1 装柱
装柱子（添硅胶）时，常用的有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。
不论干法还是湿法，硅胶（称为固定相更为广义）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右（长度没有绝对之说，根据自身情况而定，制备的大柱可以长达一米），太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。
湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压（土方法可以用养鱼的氧气泵加压或是用氮气，当然不加压也可以）用淋洗剂"走柱子"，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 （我一般都用湿法装柱）
干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧（湿法也要敲的，效果好点），至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实（一般柱子不敢用油泵抽，怕把柱子抽裂了）。接着是用淋洗剂"走柱子"，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于"走柱子"时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到）（梯度洗脱时，湿法装柱也会出现该情况，比较不好处理，可以缓慢改变溶剂，且置于通风处），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚（用乙醚最最明显），二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。
解决的办法是：
第一、硅胶一定要压结实；
第二、 一定要用较多的溶剂"走柱子"，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。
也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂(我一般垫张滤纸，撒上石英砂，再放些棉花)，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。
二、上样
上样也有干法和湿法之分：
干法（也称硅胶制沙）就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。（我一般喜欢用这种方法，除非不能用）
湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。
湿法较方便，但不溶剂让其完全被硅胶均匀吸附，不容易跑的很平整
柱层析关键在于柱子是否装好（这是最大影响因素）和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC（作用还是很大的）的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。
上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使
用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。（这一点很实用，不过有些特殊情况也不一定，如果要保险可以先做根小柱子跑一下，这样最安全，就是花点时间）
三、收集
主要依靠TLC（据说国外有石英柱，直接用荧光灯照能看出来，不过太贵了，在国内不一定适用），需要切记的是：
第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。
第二、点不能点得太浓（在最后时应该点的浓点，这样看看有无收尽产品）,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。
第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适才能有一个交好的分离效果。
选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚 展开剂的比例要靠尝试.
一般根据文献（这是首选）中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。
很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。不行可以尝试两两混合，三者混合，一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。
在利用TLC跟踪反应时，在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点一个点A，每种难挥发的原料各点一个点B,C, D等等，然后所有的原料和反应体系的混合溶剂再共同点 一个混合点X，这些点在板上的位置如图所示： A X B C D
这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置，把A这个点展开后的各个层份的 点与B,C,等原料比较，从而判断原料消失没有，点混合点X的目的在于，方便观察，因为有时候，板展开后，各点的位置有些变形，或者由于边缘效应等等，使得判断不易。（用小板，跑的快，很快见到结果，为了避免小板的边缘，用机器板较好）
利用TLC判断物质的纯度时，如果不能完全确定，可以再结合其他检测手段，如NMR，因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。
但有趣的是，由于H-NMR可鉴别 的纯度也就在95%左右，有时候H NMR现示较纯的东西，一点板就会发现有几个点。所以，两者要结合使用。如果有标准品或是以前做过的，对个对照最方便。
反相色谱柱的使用与维护
反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：
一、反相色谱柱的选择
1．柱子的PH值使用范围
反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。
2．填料的端基封尾（或称封口）
把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。
二、液相色谱柱的使用
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。
1、样品的前处理
a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不 可逆吸附的杂质。
c、使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相与样品不产生化学反应
c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a．含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲 溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。
b．流动相要求使用0.45 µm滤膜过滤，除去微粒杂质。
c．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
三． 色谱柱的维护
1. 色谱柱的平衡
反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。 每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的”补偿”，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！操作步骤：
a. 平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）
b. 如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水”过渡”即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡； 分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。
2． 色谱柱的再生
长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。
建议用来冲洗柱子的溶剂体积
色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积
125-4mm 1.6ml 30ml
250-4 mm 3.2ml 60ml
250-10mm 20ml 400ml
选择再生方法：
极性固定相（如Si，NH2* ，DIOL基色谱填料）的再生：
正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生： 水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水
注意：
a. 在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
b. 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
3. 色谱柱的维护
a．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）
b．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围
c．避免流动相组成及极性的剧烈变化
d．流动相使用前必须经脱气和过滤处理
e．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中
f．氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。
葡聚糖凝胶柱的使用方法
葡聚糖凝胶柱的使用方法：
#?/_8\'O4@*K8`-Q植提之家,植提空间,中国植提论坛,植提论坛,植提网(1) 预处理 5%+G%M.c4^)S6S3r
称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。5v7k&D*t(]3}
(2) 装柱中国植提论坛|植提网!P3n%f)G-G0d
凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。
8H$F#V3c [(3) 加样
$t.Z-X*D!W J&i 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。
6{&C!f4K1o9| ^中国植物提取物论坛(4) 洗脱与收集
)\.E"w+@&W)n$p+d P5D中国植物提取物论坛 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm，找出浓度最大的管号。
'E*L)a(^7c,P(5) 凝胶的再生和回收
4f2{3]*{)o4d.u-j,V植提之家,植提空间,中国植提论坛,植提论坛,植提网 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。植提之家,植提空间,中
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项
吸附模式 取决于所需分辩率
分子量大小 小于总体积的20%
正相分配 小于总体积的1%
12.其他
胶粒形状 球形，多孔
颗粒大小（干） 18-111um（直径）
颗粒大小中间值（干） 70um（直径）
颗粒大小（甲醇） 27-163 um（直径）
颗粒大小中间值（甲醇） 103 um（直径）
最大线性流速 720cm/min
参考线性流速 60 cm/min
pH的稳定性
操作中 2-11
清洗中 2-13
化学稳定性 在许多水溶液及有机溶剂系统中都稳定。在pH2以下或强氧化剂中不稳定
高压灭菌 121℃可忍受20分种
操作温度 4℃到40℃
保存条件
新填料 4-25℃（干燥）
使用后填料 4-8℃，pH6-8，切勿冷冻，加入抑菌剂（如20%乙醇，0.04%叠氮钠）
13.干胶溶胀表
溶剂 床体积（mL凝胶/g干胶粉末）
Dimethyl sulphoxide 二甲亚砜 4.4～4.6
Pyridine 嘧啶 4.2～4.4
Water 水 4.0～4.4
Dimethylformamide 二甲基甲酰胺 3.8～4.2
Saline 生理盐水 3.9～4.1
Methanol 甲醇 3.8～4.1
Methane dichloride 二氯乙烷 3.8～4.1
Chloroform* 氯仿 3.8～4.1
Propanol 丙醇 3.7～4.0
Ethanol** 乙醇 3.6～3.9
Isobutanol 异丁醇 3.6～3.9
Formamide 甲酰胺 3.6～3.9
Methylene dichloride 二氯甲烷 3.6～3.9
Butanol 丁醇 3.5～3.8
Isopropanol 异丙醇 3.3～3.6
Tetrahydrofuran 四氢呋喃 3.3～3.6
Dioxane 二氧杂环已烷 3.2～3.5
Acetone 丙酮 2.4～2.6
Acetonitrile*** 乙腈 2.2～2.4
Carbon tetrachloride 四氯化碳 1.8～2.2
Benzene 苯 1.6～2.0
Ethyl acetate 乙酸乙酯 1.6～1.8
Toluene 甲苯 1.5～1.6
*包含1％的乙醇
**包含1％的苯
***溶胀胶体积小于2.5mL/g的溶剂没有使用价
凝胶色谱柱的使用方法
看到很多虫友问葡聚糖凝胶的使用方法，所以将自己的一点经验写下来，以作参考。葡聚糖凝胶柱的使用方法大体有一下步骤：
(1) 预处理
称取葡聚糖凝胶（有不同型号）若干克，加入洗脱剂（通常为甲醇或者水，这里以甲醇为例）约20倍凝胶量，置室温下3h进行溶胀，溶胀必须彻底，否则会使上柱后流速变慢，凝胶断裂等。
(2) 装柱
凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边缓缓连续装入，色谱柱的出口流速m维持在5~10ml/min。凝胶颗粒沉积到柱底后关紧色谱柱，等沉降到1-2cm时再2打开色谱柱。直至降到满意高度为止，等凝胶柱内的液体留的与凝胶高度差不多时，用较小的滤纸盖住凝胶床表面，再用洗脱剂洗脱过夜。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装。
(3) 加样
装好的色谱柱至少要用相当于3倍保留体积的洗脱剂平衡，待洗脱剂流至与凝胶柱液面相平时（不能流干，否则会带入气泡），用滴管吸取样品溶液，在高于凝胶表面约1cm处，沿管壁四周缓缓滴加样品液，加完后打开下面的出口，使样品渗入凝胶内。再关闭出口，用少量洗脱液将管壁残留的样品洗下，再打开出口，至溶液渗入柱内，再关闭出口。可以考虑再加一层薄薄的脱脂棉以保护柱表面（我一般不加），然后即可进行洗脱。
(4) 洗脱与收集
洗脱时，用甲醇作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。一般酸性洗脱剂中碱性物质容易洗脱，碱性洗脱剂中酸性物质容易洗脱。多糖类物质等极性大的物质考虑用水洗脱，常用的洗脱剂是水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，一般根据自己样品的性质选择洗脱液，洗脱液可一直用单一梯度。凝胶色谱的共性是流速慢，每份一般体积较小。（内径1.3cm左右，长80cm左右的柱子我一般每份收集液为8ml）
(5) 凝胶的再生和回收
凝胶柱多次使用后，若污染严重，则考虑用50度左右的2%的NaOH和0.5mol/LNaCl混合液浸泡后，再用水洗净即可。
凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)
凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。 一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC）又称
尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC）
凝胶渗透层析（Gel Permeation Chromatography，GPC）
分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography，MSC）
注：在高效液相色谱分析中，用GFC或SEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，流动相通常是水溶液；在有机高分子分析中，常用GPC表示凝胶渗透色谱，流动相通常是有机溶剂；在蛋白质分离纯化中用GFC或SEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析；本文以下内容均针对蛋白质分离，因此均以凝胶过滤层析（GFC）表示。
（1）分离机理
GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒，利用球状凝胶内的筛孔的大小，不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异，利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。
蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短；较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长；基于此原理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。
注1：球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。
（2）应用范围
A蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离；
B分子量测定，蛋白质分子量（球形）的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系；
C样品脱盐或溶剂置换。
（3）填料要求
一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性（denature）或是其它化学反应，最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的pH和温度范围内使用。凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。
（4）凝胶过滤常用填料种类
目前常用的凝胶包括3个主要类型：
A：葡聚糖凝胶（Polydextran），商品名称是Sephadex
Polydextran几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。
Sephadex G-X，X表示葡聚糖的交联程度，数值越大则交联度越小，但吸水量越高，X值大致是吸水量的10倍。以Sephadex G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml。
Sephadex的分离范围与填料粒经和交联度密切相关，大概范围如下：
型号
粒度（微米）
有效分离范围（球形蛋白质）
G 10
55－166
<700
G 15
60-180
<1500
G 25
-
1000-5000
G 50
-
1500-30000
G 75
-
3000-80000
G 100
-
4000-150000
G 150
-
5000-300000
G 200
-
5000-600000
Superdex属于葡聚糖以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的球形凝胶，流速快、反压低。
型号
粒度（微米）
有效分离范围（球形蛋白质）
Superdex 30
24-44
<10000
Superdex 75
24-44
3000-70000
Superdex 200
10000-600000
B 聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
Polyacrylamide是一种合成凝胶，商品名Bio-Gel P，干粉颗粒状。依胶的分离范围不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。Polyacrylamide的化学性质不活泼，但它在极端的pH下会被水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性质，因此pH值应尽量控制在2-10之间。
型号
粒度（微米）
有效分离范围（球形蛋白质）
Bio-Gel P-2
-
<1800
Bio-Gel P-4
-
800-4000
Bio-Gel P-6
-
1000-6000
Bio-Gel P-10
-
1500-20000
Bio-Gel P-30
-
2500-40000
Bio-Gel P-60
-
3000-60000
C 琼脂糖凝胶
商品名称Sepharose，由属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose 2B，4B和6B。Agarose gel是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。Agarose做成beads后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。
经2，3－二溴丙醇反应交联而成的凝胶为Sepharose CL型凝胶
型号
粒度（微米）
有效分离范围（球形蛋白质）
Sepharose 2B
70000－40000000
Sepharose 4B
60000－20000000
Sepharose 6B
10000－4000000
Sepharose CL-2B
70000－40000000
Sepharose CL-4B
60000－20000000
Sepharose CL-6B
10000－4000000
Superpose琼脂糖经多次交联形成的凝胶。
型号
粒度（微米）
有效分离范围（球形蛋白质）
Superose 6
5000－5000000
Superose 12
1000－300000
其它凝胶：聚丙稀酰胺葡聚糖凝胶，交联聚苯乙烯凝胶，聚乙烯醇凝胶等，还有更多新型号的凝胶。
4 操作实例（转载）
1） 凝胶溶胀
凝胶颗粒要求大小比较均匀
，可流速稳定，结果较好。取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天（溶胀时间因凝胶交联度不同而不同），或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。
色谱分离技术
4[7P'D%d:o/~$N9k中国植物提取物论坛 色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。
8G)W;]1j3T"j1Z's:J8{ 色谱有多种，按固定相类型和分离原理可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、亲和色谱、大孔吸附树脂、凝胶色谱、聚焦色谱等。最常用的是吸附色谱分离技术。
吸附色谱法是指混合物随流动相通过吸附剂（固定相）时，由于吸附剂对不同物质具有不同的吸附力而使混合物中各组分分离的方法。此法特别适用于脂溶性成分的分离。被分离的物质与吸附剂、洗脱剂共同构成吸附层析的三要素，彼此紧密相连。
+\(f4N9{ W4T中国植物提取物论坛 常用的极性吸附剂有：硅胶、氧化铝。硅胶显弱酸性，适于分离酸性和中性化合物，分离生物碱时需在流动相中加入适量的有机碱；氧化铝呈碱性，适于分离生物碱等碱性成分，不宜用于分离有机酸等酸性成分。极性吸附剂的吸附作用有以下特点。 Y!s+i0C,S%j&p#I#p$O,E
1．被分离物质极性越强，吸附力越强。强极性溶质将优先被吸附。植提之家,植提空间,中国植提论坛,植提论坛,植提网'_1i,~+u9Y7^'|:G8f
2．溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质的吸附能力越强。随溶剂极性的增强，则吸附剂对溶质的吸附力将减弱。www.plantextra.com$~)m7O0z.O&r
3．当加入极性较强的溶剂后，先前被硅胶或氧化铝所吸附的溶质可被置换而洗脱出来。中国植提论坛|植提网7w5c5c-j7W%N1P.Y
活性炭是常用的非极性吸附剂。活性炭对非极性物质具有较强的亲和力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。从活性炭上洗脱被吸附的物质时，溶剂的极性越小，洗脱能力越强。中国植提论坛|植提网"V:|2A9]'f.z!H4M;c(P1l'G!r
一般化合物的极性按下列官能团的顺序增强:
8\9S-k"_/K8^中国植物提取物论坛 —CH2—CH2—，—CH＝＝CH—，—OCH3，—COOR，＞C＝＝O，—CHO，—NH2，—OH，—COOH。*g1o9r4Z&F!t8V
溶剂的极性可大体根据介电常数的大小来判断。介电常数越大，则极性越大。一般溶剂的介电常数按以下顺序增大：环已烷（1.88），苯（2.29），无水乙醚（4.47）， 中国植提论坛|植提网/j6A(p*Q$p)a.E
氯仿（5.20），乙酸乙酯（6.11），乙醇（26.0），甲醇（31.2），水（81.0）。:L.b(A6X2F&s#C
吸附色谱的操作方式主要有薄层色谱法和柱色谱法。薄层色谱法是将吸附剂均匀铺在玻璃上，点样，然后用合适的展开剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的。柱色谱是将待分离的样品均匀加入到装有固定剂填料的柱子内，再以适当的洗脱剂洗脱以达到不同成分的分离。 ^6W$\+c;v&q
色谱分离技术常用于功能性的分离精制。例如，从茶叶中提取茶多酚时可采用层析法分离除去咖啡因及其他不纯物；从橘皮的超临界萃取液中分离提取类胡萝卜素；从芝麻粕提取液中分离提取木聚糖；从蔗糖的酶处理液中分离精制低聚果糖；从牛初乳中分离提取乳铁蛋白；从磷虾酶解残渣抽提液中分离提取虾黄素、卵磷脂等。
